Transduktion von Apoptosesignalen in ejakulierten Spermatozoen nach Kryokonservierung via Aktivierung von Caspasen

Journal für Fertilität und Reproduktion 2003; 13 (2) (Ausgabe für Schweiz): 20-27
Journal für Fertilität und Reproduktion 2003; 13 (2) (Ausgabe für Österreich): 22-31

Volltext (PDF)    Summary    Abbildungen   




Keywords: Aktivierung,  Apoptose,  Caspase,  Fertilität,  Kryokonservierung,  Spermatozoen

Einleitung: Es wurde untersucht, inwieweit Schädigungen der Spermienmembran mit zytosolischen Signalen der Apoptose, dem programmierten Zelltod, assoziiert sind. Diese Signale werden insbesondere durch Aktivierung von Caspasen vermittelt. Die Membran einer apoptotischen Zelle zeigt eine Externalisation von Phosphatidylserin (PS), das in intakten, nicht-apoptotischen Zellen nur auf der zytoplasmatischen Seite lokalisiert ist. Dieses Phänomen wurde genutzt, um ejakulierte Spermatozoen in Abhängigkeit von der Bindung von Annexin V-konjugierten MicroBeads (ANMB) und der superparamagnetischen Zellseparationstechnik (MACS) in zwei Zellpopulationen zu trennen: in eine ANMB-negative mit intakter Membran und in eine ANMB-positive. Annexin V kann die intakte Membran nicht passieren und deshalb PS in intakten Spermien nicht erreichen. Eine ANMB-Bindung ans Spermium charakterisiert entweder eine Externalisation von PS als frühes Ereignis der Apoptose oder eine allgemeine Beeinträchtigung der Membranintegrität. Patienten und Methoden: Zwanzig Ejakulate von 10 gesunden Probanden wurden gesplittet und eine Hälfte kryokonserviert. In den frischen und kryokonservierten Spermaproben wurde vergleichend die Aktivierung der Caspasen (aCP) 8, 9, 1 und 3 in Abhängigkeit von der Annexin V-Bindung flowzytometrisch untersucht. Ergebnisse: Alle untersuchten Caspasen wurden erstmals im Spermienzytosol nachgewiesen. Außer Caspase 9, die eine mitochondriale Mittelstückfluoreszenz zeigte, wurden alle Caspasen postakrosomal lokalisiert. Die Kryokonservierung führte zu einer signifikanten Erhöhung des Anteils von Spermatozoen mit aktivierten Caspasen (15,7% in frischen vs. 40,8% in kryokonservierten Spermien, p kleiner 0,01). Die MACS-Technik separierte in Abhängigkeit von der ANMB-Bindung an das Spermien-PS eine ANMB-negative Spermienfraktion mit hochsignifikanter Verminderung (p kleiner 0,01) von Spermien mit aktivierten Caspasen. Auch nach der Kryokonservierung war der Trenneffekt von MACS signifikant, jedoch unterschieden sich bezüglich der Caspase-Aktivierung die frischen ANMB-negativen Spermien nicht signifikant von den kryokonservierten ANMB-negativen Spermien (p grüßer 0,05). Infolge der Kryokonservierung erhöhte sich allerdings signifikant (p kleiner 0,01) die Chance eines Spermatozoons mit dem Verlust der Membranintegrität, auch Caspasen zu aktivieren. Zusammenfassung: Es wurde erstmals die Präsenz und koordinierte Kompetenz von zytosolischen Apoptosesignalen in Form aktivierter Caspasen in ejakulierten Spermatozoen aufgezeigt. Die Kryokonservierung führte zu einer signifikanten Aktivierung dieser Enzyme. Die Trennung der Spermatozoen in Abhängigkeit von ihrer Annexin V-Bindung führte zu einer signifikanten Verminderung von Spermien mit aktivierter apoptotischer Signalkaskade, sowohl in nativen als auch in kryokonservierten Spermaproben mit erhöhter Membranschädigung. Aktive Caspasen waren aber auch zu einem Anteil zwischen 7% und 14% in frischen Spermatozoen mit intakter, nicht-apoptotischer Membran zu finden. Aufgrund des sehr weiten Substratspektrums der terminalen Caspase 3 in den Spermien ist eine Beeinflussung der fertilen Potenz des Spermatozoons nach Aktivierung sehr wahrscheinlich.