Forschungsbericht: Molekulare Mechanismen männlicher Infertilität – Ergebnisse der Klinischen Forschergruppe KFO 181 (Leiter: K. Steger, Sprecher: W. Weidner) //Mechanisms of Male Factor Infertility – Data from the Clinical Research Unit KFO 181

Journal für Reproduktionsmedizin und Endokrinologie - Journal of Reproductive Medicine and Endocrinology 2016; 13 (4): 138-147

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Keywords: Epigenetik,  KFO 181,  männliche Fertilität,  Spermatogenese,  Spermienqualität,  epigenetics,  KFO 181,  male fertility,  sperm quality,  spermatogenesis

• Einleitung

Die Klinische Forschergruppe (KFO) 181 „Molekulare Mechanismen männlicher Infertilität“ wurde von Dezember 2008 bis Februar 2016 von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert, wobei 50 % der Mittel anteilig von den Fachbereichen Human- und Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität (JLU) Gießen sowie dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg (PMR) getragen wurden. Entsprechend den Statuten der DFG zur Einrichtung von KFOs, deren primäres Ziel die Etablierung von universitären Schwerpunkten ist, wurde parallel zur ersten Förderperiode eine Forschungsprofessur (W2) geschaffen, die durch ein ordentliches Berufungsverfahren mit Prof. Dr. Klaus Steger besetzt wurde. Die Professur für Molekulare Andrologie ist der Klinik und Poliklinik für Urologie, Kinderurolo­gie und Andrologie zugeordnet und wird nun vom Fachbereich Humanmedizin der JLU Gießen getragen.

Im Rahmen der KFO 181 wurden in ­zuletzt acht Teilprojekten jeweils unterschiedliche Zellen des Hodens an menschlichen Biopsiematerial und Samenproben sowie am Tiermodell (Maus, Ratte, Rind) mit dem Ziel einer Verbesserung des Verständnisses molekularer Regulationsmechanismen während der normalen und gestörten Keimzell­entwicklung untersucht (Abb. 1). Da die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung des Hodens eine wichtige Rolle für die Keimzelldifferenzierung spielt, untersuchte ein Projekt die Auswirkungen einer Atherosklerose-bedingten Mangeldurchblutung am Beispiel des ApoE–/–/LDLR–/–-Mausmodells. Ein weiteres Projekt analysierte im Rattenmodell die Folgen einer durch uropathogene Escherichia coli (E. coli)(UPEC) induzierten Hodenentzündung auf die Spermatogenese. Da Entzündungsreaktionen durch fettreiche Ernährung gefördert werden können, wurden am Beispiel des Pex13–/–-Mausmodells untersucht, welche Effekte ein gestörter Fettstoffwechsel auf die Zellen des Hodens haben kann. Zwei weitere Projekte beschäftigten sich mit der Keimzell-Sertolizell-Interaktion während der Meiose und der Regulation der Gen­expression in postmeiotischen haploiden Spermatiden. Mithilfe von „time lapse imaging“ konnten neue Erkenntnisse zum Transport­mechanismus unbeweglicher Spermatozoen vom Hoden zum Nebenhoden gewonnen werden. Einen weiteren Schwerpunkt bildete der Histon-Protamin-Austausch in haploiden Spermatiden sowie die Bedeutung der in den Spermatozoen verbleibenden Resthistone. Diese Thematik wurde von der Kerngruppe der KFO 181 anhand von zwei Projekten an menschlichen Samenproben und am Tiermodell Rind bearbeitet.

Neben der Klärung von molekularen Regulationsmechanismen, die in die Keimzellentwicklung involviert sind, war das gemeinsame Ziel der Gruppe eine Verbesserung des aktuellen Verständnisses zur Diagnose der idiopathischen männlichen Infertilität. Zusammenfassend lassen die von den einzelnen Teilprojekten generierten Ergebnisse auch auf molekularer Ebene einen multifaktoriellen Ursachenkomplex der männlichen Infertilität vermuten. Letztlich konnten von der Gruppe jedoch zwei Patente für einen Test zum Nachweis von Autoantikörpern gegen testikuläre Antigene und für einen Schnelltest zur Bestimmung der Spermienqualität erzielt werden. Beide Tests befinden sich derzeit in der Entwicklung.

Atherosklerose-bedingte Spermatogenesestörungen: Ergebnisse vom ApoE–/–/LDLR–/–-
Knockout-Mausmodell und prospektive Studien am Menschen (WW, TL, RM)

Die Rolle von vaskulären Faktoren für die männliche Infertilität ist bislang völlig unklar. Im Hoden werden gefäßassoziierte Störungen der Spermatogenese vermutet. Zur Durchführung detaillierterer Analysen wurde von unserer Arbeitsgruppe das ApoE–/–/LDLR–/–-Rezeptor-Mausmodell etabliert, wobei das Muta­tionsmodell (KO) mit dem Wild-typ (WT) in ansteigenden Altersschritten (von 20–87 Wochen) verglichen wurde. Erste Untersuchungen zeigten in den KO-Mäusen eine deutliche Störung der Spermato­genese mit einer Reduktion der Spermienzahl in den Tubuli seminiferi [1]. Eine quantitative MikroCT-Analyse wies eine damit assoziierte Reduktion der Hodenvolumina und des vaskulären Volumens im Vergleich zu den Kontrolltieren nach. Eine additiv durchgeführte stereologische Untersuchung in Semidünnschnitten bestätigte die MikroCT-Befunde. Darüber hinaus konnte eine signifikante Verminderung der Länge und des Volumens in den testikulären Kapillaroberflächen der KO-Mäuse nachgewiesen werden. Diese Veränderungen assoziierten mit einer verstärkten Expression von Entzündungsparametern in den Hoden der KO-Mäuse. Begleitet wurde diese testikuläre Reaktion durch einen Abfall des Serum-Testosteronspiegels. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung einer direkten Verbindung zwischen einer veränderten arteriellen Blutzufuhr am Hoden und männlicher Infertilität. Es war keine Altersabhängigkeit nachzuweisen. Als entscheidende ätiopathogenetisch zu diskutierende Veränderungen erschienen uns die reduzierte Dichte der mikrovaskulären Struktur, der Abfall des Serum-Testosteronspiegels und die vermehrte Expression von Entzündungs­parametern. Die Daten unterstreichen die Bedeutung einer testikulären mikrovaskulären Störung (und eventuell einer konsekutiv gestörten Spermatogenese) bei nachgewiesener Hypercholesterin­ämie und Atherosklerose im Tiermodell.

In einer Kohorten-Studie an Männern mit nicht-obstruktiver Azoospermie zeigte sich in einer Pilotanalyse eine Korrela­tion zwischen einer reduzierten testikulä­ren Durchblutung (Duplex-Sonographie: reduzierte „peak flow velocity“) und der Qualität der Spermatogenese nach histologischer Aufarbeitung anhand eines Spermatogenese-Scores. Die Bewertung dieser klinischen Befunde steht noch aus.

Molekulare Mechanismen einer durch uropathogene E. coli (UPEC) verursachten Hodenentzündung und gestörten Spermatogenese (AM, TC)

Infektionen und Entzündungen des männlichen Reproduktionstraktes gehören mit etwa 14 % der Fälle zu den häufigsten Ursachen einer männlichen Infertilität. Dabei stellen E. coli Serovare eine wesentliche Erregergruppe bei Infekten des männlichen Genitaltraktes dar. Dies liegt darin begründet, dass besonders uro­pathogene E. coli (UPEC) prävalent bei Harnwegsinfekten vorkommen und die beim Mann mit den Harnwegen anastomosierenden Genitalwege eine direkte Infektionsausbreitung begünstigen.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass UPEC in Sertoli-Zellen, peritubulären Zellen und testikulären Makrophagen den proinflam­matorischen MyD88-abhängigen NFkB-Signalweg innerhalb der Zelle auf unterschiedlichen Ebenen blockieren können. Diese Hemmung resultiert in ­einer Unterdrückung der Sekretion von Zytokinen wie IL-6 und TNF-?, die wesentlicher Bestandteil einer antibakteriellen Immunantwort sind [2]. Stattdessen gelingt es UPEC, die Immunantwort der Zelle zu einer gegen Bakterien wenig wirksamen antiviralen Antwort zu manipulieren, die statt über MyD88 durch den Interferon-related factor-3 (IRF-3) vermittelt wird. UPEC kann folglich das ­intrazelluläre Signal, welches durch das Erkennen von E. coli-Komponenten durch die genannten testikulären Zellen aus­gelöst wird, so manipulieren, dass die Wahrscheinlichkeit für ein Überleben des Erregers erhöht wird, da die durch IRF-3 induzierten Typ-I- und -II-Inter­ferone sowie das „IFN-g-inducible protein 10“ (IP-10) und ­RANTES nur eine geringe antibakterielle Wirksamkeit aufweisen [2].

Auf Erregerseite gelang es, mithilfe von Mutanten und einer Gesamtgenom-Expressionsanalyse mit alpha-Hemolysin, einen zentralen UPEC-Virulenzfaktor zu identifizieren, der für die Deviation der Immunantwort der Wirtszellen verantwortlich ist [3].

Die Antibiotikatherapie ist als Behandlungsoption bakterieller Epididymo-Orchitiden etabliert. Jedoch treten immer häufiger Resistenzproblematiken auf, welche die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien erfordern. Hier bieten prinzipiell die im männlichen Reproduktionstrakt exprimierten Defensine, eine Gruppe basischer antimikrobieller Peptide, neue Ansatzmöglichkeiten. Bestimmte Defensine werden spezifisch nur im Hoden, eine andere Gruppe ausschließlich im Nebenhoden synthetisiert. Sie wirken unspezifisch gegen Bakterien. Bei UPEC-Infekten in einem bakteriellen Rattenmodel der Epididymo-Orchitis zeigte sich eine starke Inhibition der Expression von Defensinen, wie ­Defensin-21, und Defensin-ähnlichen Molekülen, wie Spag11 (Sperm-associated antigen-11) im infizierten Hoden und Nebenhoden. Die beobachtete Hemmung erfolgte überraschend, da in vielen anderen Systemen eine bakterielle Infektion zu einer Synthesesteigerung führt, um die Pathogene zu eliminieren [4].
Die Applikation von rekombinantem Defensin-21 in UPEC-infizierten Ratten konnte die bakterielle „Last“ im Reproduktionstrakt substantiell reduzieren [4].

Im Hoden resultierte die UPEC-Infek­tion in einer starken Störung der Spermatogenese, verursacht durch Keimzell­verlust. Es wurden aber auch Schäden
in den somatischen Zellen des Hodens gefunden, die besonders im Fall der Sertoli-Zellen zu einem sekundären Keimzellverlust führen können. Die Aktivierung von klassischen Apoptosemarkern wie Caspase-8, Caspase-3/6, Caspase-1 sowie das Vorkommen von 180 bp DNA-Fragmenten konnte jedoch nicht beobachtet werden. Als Indikator für den ­nekrotischen Zelltod wurde die passive Abgabe von „high mobility group box protein-1“ [HMGB1] im Infektions­mo­dell in vivo dokumentiert [5]. Dies deutet auf Nekrose als vorherrschende Form des Zelltodes bei UPEC-Infekten des Hodens hin, mit der Konsequenz, dass nekrotische Zellbestandteile – im Gegensatz zur Apoptose – die inflammatorische Antwort weiter stimulieren und damit den Gewebeschaden erhöhen.

Die Bedeutung von Peroxisomen für Hodenfunktion und Fertilität [EBV, GL]

Peroxisomen sind Zellorganellen, die in fast allen eukaroytischen Zellen vorkommen und unter anderem wichtige Funk­tio­nen im Stoffwechsel von Lipiden – wie den langkettigen und mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) – und von reaktiven Sauerstoffverbindungen erfüllen [6]. Bei Erkrankungen, die auf einer Störung der Peroxisomenfunktion beruhen, kommt es neben neurologischen Symptomen auch zu Störungen in der Hodenentwicklung und der Keimzellreifung [7–11].

Eine detailliertere Charakterisierung der Peroxisomen im Hoden zeigte, dass diese bezüglich ihres Protein­musters in den verschiedenen Zellarten des Hodengewebes heterogen waren, was auf eine unterschiedliche Funktion dieser Organellen in den verschiedenen Zellarten hinweist [12–14]. Im Rahmen dieses Projekts wurden mithilfe verschiedener Zelltyp-spezifischer konditionaler Cre/­loxP-Pex13-Knockout-Mausmodelle [15] sowie dem siRNA-vermittelten Knockdown von Pex13 in Zellkulturen die Rolle der Peroxisomen für die Fertilität des Mannes in der Protektion der Spermatogenese und der endokrinen Funktion des Hodens systematisch untersucht. PEX13 ist ein peroxisomales Membranprotein, das essentiell für den Import der Proteine in die Peroxisomenmatrix ist. In Pex13-defizienten Zellen wird ein Komplettausfall der peroxisomalen Stoffwechselwege erzeugt, wodurch dessen Auswirkungen und die Rolle der Peroxisomen Zelltyp-spezifisch im Hoden analysiert werden ­konnte.

Erzeugung und Auswirkungen zellspezifischer Peroxisomendysfuntion im Hoden

Der Knockout des Pex13-Gens erfolgte über verschiedene cre-Linien in Spermatogonien (Stra8-cre/Pex13flox), runden Spermatiden (Prm-cre/Pex13flox) und Sertoli-Zellen (AMH-cre/Pex13flox). In Leydig-Zellen wurde die peroxisomale Funktion über einen Pex13 siRNA-vermittelten Knockdown gestört. Der induzierte Funktionsausfall der Peroxisomen führte sowohl in Keimzellen als auch in somatischen Zellen (Sertoli-Zellen) zu schweren Beeinträchtigungen der Spermatogenese und der endokrinen Funktionen des Hodens (Sertoli-Zellen und ­Leydig-Zellen). In den jeweiligen Pex13-defizienten Tieren (Spermatogonien, Sertoli- und Leydig-Zellen) war die Kata­lase, ein klassisches peroxisoma-
les Matrixprotein, bei den jeweiligen Knockouts bzw. Knockdowns in das Zytoplasma mislokalisiert, was die zelluläre Situation bei peroxisomalen Erkrankungen des Menschen widerspiegelt [6]. Weiterhin konnte eine Akkumulation von rein peroxisomal verstoffwechselten Fettsäuren (z. B. sehr langkettige Fettsäuren = VLCFA), verzweigtkettige Fettsäuren (Ausnahme postmeiotischer Pex13 KO) sowie Veränderungen in peroxisomalen Syntheseprodukten (Docosahexaensäure = DHA) nachgewiesen werden.

Spezifische Spermatogeneseveränderungen

Der prämeiotische Pex13-Knockout (­Stra8-cre/Pex13KO) führte zu einem Arrest der Spermatogenese auf Spermatidenniveau mit deutlich nachweisbarer zytoplasmatischer Katalase in multinu­kleären Riesenzellen und zur Azoospermie, während männliche Mäuse mit postmeiotischem Pex13-Knockout eine normale Fertilität besaßen und in späten Spermatiden auch keine zytoplasmatische Katalase aufwiesen (Abb. 2). Ähnliche multinukleäre Riesenzellen wurden auch bei einem Mausmodell mit Störungen der peroxisomalen Plasmalogensynthese [16] und bei generellen zellulären Defekten des Lipidmetabolismus [17] beschrieben. Im Gegensatz hierzu entwickelten Sertoli-zellspezifische Pex13-Knockout-Mäuse ein komplettes Sertoli Cell Only- (SCO-) Syndrom mit gleichzeitig einhergehender Proliferation von Leydig-Zellen. Dieses Modell ähnelt einem Pex5-Knockout in Sertoli-Zellen [18].

Veränderungen der endokrinen Hodenfunktion

Die Leydig-Zell-Proliferation in Sertoli-zellspezifischen Pex13-Knockout-Mäusen führte zur Aufrechterhaltung des Testosteronspiegels, allerdings wurden eindeutige Veränderungen im Bereich der Androgenvorstufen und der Östrogene im Hoden nachgewiesen. Eine klare Androgen-Östrogen-Dysbalance mit einer eindeutigen Verringerung der Testosteronsynthese und einer Akkumulation von Östradiol wurde nach funktioneller Störung des peroxisomalen Stoffwechsels durch spezifischen Knockdown von Pex13 in primären Leydig-Zellen und in einer Leydig-Tumorzell-Linie nachgewiesen. Diese Befunde lassen auf eine vorhandene Androgen-Östrogen-Dys­balance bei Kindern mit peroxisomalen Biogenesedefekten schließen, was die beschriebenen Phänotypen des Kryptorchismus bei Knaben oder der Klitero­megalie bei Mädchen mit Zellweger-Syndrom, der schwersten Form eines peroxisomalen Biogenesedefekts, erklären könnte [11, 19].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die normale Biogenese der Peroxisomen und der peroxisomale Stoffwechsel für die Aufrechterhaltung der männlichen Fertilität essentiell sind und deren Ausfall in den meisten Zellen des Hodens zur männlichen Infertilität führt.

Untersuchung TGF-beta-regulierter Proteine in Sertoli-Zellen (LK)

Clusterin (CLU) ist ein ubiquitär exprimiertes heterodimeres Glykoprotein, das bei vielen Funktionen wichtig ist, z. B. Zell-Zell-Interaktionen, Apoptose, Epithelial-mesenchymale Transition, Karzinogenese und als Chaperon bei z. B. Morbus Alzheimer [20]. Ursprünglich wurde CLU als ein Androgen-reprimiertes Protein in der Prostata identifiziert und ist auch als „testosterone-repressed prostate message“, „glycoprotein-80, serum protein-40,40, dimeric acidic glycoprotein“, „sulfated glycoprotein-2“, „complement lysis inhibitor“ und Apolipoprotein-J bekannt [20]. Im Hoden ist CLU fast ausschließlich in Sertoli-Zellen exprimiert, reduzierte CLU-Spiegel wurden bei männlicher Infertilität gefunden [21, 22]. Darüber hinaus ist nur wenig über seine Funktion bekannt. In dieser Studie wurde primär der Einfluss von CLU auf die Meiose untersucht.

Wir fanden eine Hoch-Regulation von CLU durch die „transforming growth factors-beta“ (TGF?1–3) und eine Inhibition der Staurosporin-induzierten Apoptose durch CLU. Die CLU-Rezeptoren sind die Multi-Liganden-Rezeptoren „very low density lipoprotein receptor“ (VLDLR) und der Apolipoprotein-E-Rezeptor-2 (ApoER2), weil durch einen spezifischen Inhibitor von VLDLR/ApoER2 die Phosphorylierung von Akt und damit der CLU-Signalweg verhindert wird [23]. Wir fanden ebenfalls eine Hoch-Regulation von Meiose-assoziierten Proteinen (Stra8, MYBL1, CREB und LDHC) in Tubulus-Kulturen nach Behandlung mit rekombinantem CLU. Zum Beispiel zeigte sich eine deutlich gesteigerte Proteinexpression von Stra8, das im Hoden nur in prämeiotischen Keimzellen exprimiert ist und als „Torwächter“ der Meiose gilt [24].

Ein anderer Teil des Projektes beschäftigte sich mit der verbesserten Diagnose der männlichen Infertilität. Wir konnten bereits zeigen, dass bei infertilen Patienten sowohl die Anzahl an Sertoli-Zellen als auch die Stammzellpopulation der Keimzellen zusätzlich zu den am besten untersuchten Meiose-Defekten reduziert waren [25]. Im Anschluss konzentrierten wir uns auf die Effizienz des Eintritts in die Meiose.

Zur Analyse von Patienten mit Azoospermie und definierten Spermatogenese-Defekten wurden OCT2 für Typ-A-Spermatogonien, Sarcoma antigen-1 (SAGE1) für Mitose-Meiose-Transition [26, 27] und Smad3 für pachytäne Spermatozyten [25] verwendet. Besonders Patienten mit einem Reifungsarrest (primäre Spermatozyten) hatten eine signifikant reduzierte Anzahl von Typ-A-Spermatogonien. Des Weiteren waren SAGE1-positive Spermatogonien deutlich reduziert in Fällen mit Hypospermatogenese und Reifearrest und bestätigte ältere Arbeiten [28, 29]. Aber es ist wichtig zu ermitteln, ob der mitotische Defekt nicht schon vorher besteht; das bedeutet, ob nicht bereits die Anzahl der Spermatogonien reduziert ist. In den untersuchten Fällen zeigte sich, dass bei Patienten mit Reifearrest die reduzierte Anzahl an Typ-A-Spermatogonien (54 %) ähnlich hoch wie die reduzierte Anzahl an sich teilenden/differenzierenden SAGE-positiven Spermatogonien (42 %) ist. Aus diesen Ergebnissen kann man schlussfolgern, dass der Defekt eher bei den frühen Spermatogonien und weniger bei der Mitose liegt.

Für eine detaillierte individuelle Klassifikation der Patienten unterschieden wir zwischen „hoher Effizienz des Meiose-Eintritts” (große Zahl pachytäner Spermatozyten) und „geringer Effizienz des Meiose-Eintritts” (niedrige Zahl pachytäner Spermatozyten). Nur Patienten mit histologisch normaler Spermatogenese oder Hypospermatogenese zeigten eine normale Anzahl an Spermatogonien und eine hohe Effizienz des Meiose-Eintritts. Dagegen hatten Patienten mit Reifungsarrest immer eine niedrige Effizienz des Meiose-Eintritts [30]. Die Analyse der Meiose zeigte bis zu 50 % reduzierte ­Rekombinationsraten in Fällen mit Reifungsarrest [31, 32], ebenso wie eine 6-fach erhöhte Frequenz an genetischen Abnormalitäten in Fällen mit Reifungsarrest versus Hypospermatogenese [33]. In allen diesen Fällen wurde aber nicht die Anzahl der Spermatogonien oder der Meiose-Eintritt bestimmt.

Die individuelle Klassifizierung von männlichen Patienten mit gestörter Spermatogenese besonders der frühen Phase ist eine wichtige Erweiterung des Klassifizierungssystems von Bergmann und Kliesch [34]. Im Wesentlichen konnte bei männlichen Patienten mit gestörter Spermatogenese gezeigt werden, dass (1.) Sertoli-Zahlen reduziert sein können, (2.) Spermatogonien-Zahlen reduziert sein können und (3.) kompensatorische Mechanismen in der Meiose vorhanden sein müssen, um diese frühen Spermatogenese-Defekte ausgleichen zu können.

• Die Transkriptionphase in haploiden Spermatiden korreliert mit dem Auftreten verschiedener Histon­modifikationen und der differentiellen Expression zahlreicher, neusynthetisierter Bromodomänenproteine und Transkrip­tionsfaktoren (CR, RRP)

Während der Spermatogenese durchlaufen die männlichen Keimzellen zahlreiche Differenzierungsschritte, die zur Entwicklung eines hochspezialisierten Spermiums führen. Diese Differenzierungsschritte unterliegen einem streng kontrollierten Genexpressionsprogramm. In der postmeiotischen Phase der Spermienreifung, der Spermiogenese, finden enorme morphologische Zellveränderungen statt, die durch zahlreiche verschiedene Proteine gewährleistet werden. Diese Proteine entstehen hauptsächlich aus translational reprimierten und gespeicherten mRNAs.

Bei Drosophila findet die Synthese dieser Spermiogenese-relevanten mRNAs in primären Spermatozyten statt, die Transkription der entsprechenden Gene ist von Testis-spezifischen TATA-Box-Bindeprotein- (TBP-) assoziierten Faktoren [tTAFs] und von Testis-spezifischen Bromodomänenproteinen (tBRDs) abhängig [35, 36]. Zudem wird postuliert, dass tTAFs an den Spermiogenese-relevanten Genen als Gegenspieler von Polycomb agieren [37].

Bei der murinen Spermatogenese steigt die Transkription von 1652 Genen während oder nach der Meiose drastisch an [38]. Proteine, die zu einem späteren Zeitpunkt der Spermiogenese benötigt werden, z. B. Protamine, basieren auf translational reprimierten und gespeicherten mRNAs, die bereits in runden Spermatiden synthetisiert werden [39]. Insgesamt werden etwa 2375 Gene in meiotischen und postmeiotischen männlichen Keimzellen transkribiert [38]. Zudem wurden die TAF-Varianten TAF4B und TAF7L in frühen Spermatiden von Mäusen detektiert [40, 41]. Das spezifisch im Hoden exprimierte Bromodomänenprotein BRDT ist in Spermatozyten und in frühen Spermatiden nachweisbar [42]. Dennoch ist bisher wenig über die Transkription Spermiogenese-relevanter Gene in Säugetieren bekannt. ­Daher haben wir uns die Frage gestellt, ob bei Säugetieren, genau wie bei Drosophila, spezialisierte Transkriptionsinitiationskomplexe existieren.

Zu Beginn unserer Arbeiten wollten wir uns ein eigenes Bild über die Verteilung von TAF4B in männlichen Keimzellen verschaffen. Dazu wurden drei verschiedene TAF4B-Antikörper (darunter auch der in [41] verwendete) an humanen Hodenbiopsie-Proben und an unterschiedlich fixierten murinen Hodenschnitten getestet. Mit keinem der Antikörper konnte ein Signal in frühen Spermatiden detektiert werden. Stattdessen war TAF4B in Spermatogonien und in Spermato­zyten von Mäusen und in humanen Spermatogonien zu detektieren. Zudem konnte mittels qPCR eine signifikante Anreicherung von TAF4B in Spermato­zyten im Vergleich zu postmeiotischen Spermatiden nachgewiesen werden. Diese Daten deuteten darauf hin, dass TAF4B keine essentielle Rolle bei der Transkription der Spermiogenese-relevanten Gene spielt.

Zudem waren die Transkripte der kanonischen TAFs TAF2, TAF5, TAF6, TAF9, TAF10 und TAF12 sowie die der TAF-Varianten TAF5L and TAF6L in frühen Spermatiden signifikant angereichert. Die Anreicherung dieser TAFs auf Proteinebene in humanen und murinen Spermatiden wurde exemplarisch immunhistologisch validiert. Es scheint offensichtlich, dass viele der kanonischen TAFs eine Rolle bei der Transkription der Spermiogenese-relevanten Gene spielen. Interessanterweise scheinen TAF5 und TAF5L sowie TAF6 und TAF6L in Spermatiden gleichzeitig aufzutreten. Kürzlich wurde gezeigt, dass TAF7L mit TRF2 kooperiert und eine Gruppe von Genen in Spermatiden aktiviert [43].
Es wäre denkbar, dass in frühen Spermatiden verschieden zusammengesetzte TFIID-Komplexe existieren, die jeweils bestimmte Gruppen von Genen regulieren. Neben zahlreichen TAFs waren die Transkripte der Bromodomänenproteine BRD1, BRD2, BRD3, BRD7, BRD8, PCAF, SMARCA2 und TRIM24 in frühen Spermatiden signifikant angereichert. Die Transkripte der Polycomb-Proteine RING1, BMI1, SCMH1 und EZH2 zeigten ebenfalls eine signifikante Anreicherung in frühen Spermatiden. Die Anreicherung der entsprechenden Proteine in humanen und murinen Spermatiden wurde exemplarisch immunhistologisch validiert. Zudem zeigten immunhistologische Untersuchungen, dass die Transkription in Spermatiden von Mäusen und beim Menschen zum Erliegen kommt, noch bevor Protamine zu detektieren sind [44].

Des Weiteren zeigten immunhistologische Untersuchungen, dass zu Beginn der postmeiotischen Transkription eine Hyperacetylierung von Histon H4 zu detektieren ist (K5ac, K8ac und K16ac bei Mäusen; K5ac, K8ac und K12ac beim Menschen). Diese Hyperacetylierung nimmt mit Fortschreiten der Transkrip­tionsphase ab und steigt am Ende wieder an. Dieser Wiederanstieg repräsentiert die in der ­Literatur beschriebene Hyperacetylierung beim Austausch der Histone durch Protamine [45]. Unsere Daten sind konträr zu denen anderer Publika­tionen, die Histone in den meisten ­runden Spermatiden als nicht-acetyliert beschreiben [46]. Es wird postuliert, dass BRD2 Transkriptionsfaktoren, His­ton­acetyltransferasen und Chromatin-Remodeller zu Promotoren rekrutiert, indem es eine Art Gerüst am Chromatin bereitstellt [47–50]. Für BRDT wurde gezeigt, dass es eine Rolle bei der richtigen Expression einer Gruppe von Genen in frühen Spermatiden spielt [51, 52]. Die Acetyltransferase PCAF agiert als Transkriptions-Kofaktor und bildet mit mehr als 20 weiteren Proteinen den sogenannten PCAF-Komplex. Dieser Komplex beinhaltet, genau wie der TFIID-Komplex, die Histon-ähnlichen Untereinheiten TAF9, TAF10 und TAF12 und bildet eine Histon-Oktamer-ähnliche Struktur aus [53, 54]. Zusätzliche Komponenten des PCAF-Komplexes sind
die TAF-Varianten TAF5L und TAF6L [55].

Wir konnten in runden Spermatiden Komponenten des kanonischen TFIID-Komplexes, des PCAF-Komplexes, TAF-Varianten sowie verschiedene Bromodomänenproteine nachweisen und postulieren daher, dass in Spermatiden verschieden zusammengesetzte Transkriptionskomplexe, bestehend aus unterschiedlichen TFIID-Komplexen, verschiedenen Bro­mo­domänenproteinen und dem PCAF-Komplex existieren, die jeweils unterschiedliche Gruppen von Genen regulieren.

• Besonderheiten der für den Spermatozoentransport notwendigen Kontraktilität von Samen­kanälchen und Neben­hodengang (RM)

Der Transport von Spermatozoen, die noch unbeweglich aus dem Keimepithel freigesetzt werden, und ihre ordnungsgemäße Reifung hängt entscheidend von der Aktivität glatter Muskulatur, die die Tubuli seminiferi und den Ductus (D.) epididymidis umgibt, und von ihrer lokalen noch unzureichend verstandenen Regulation ab [56, 57]. Zur Charakterisierung der kontraktilen Aktivität des kaudalen D. epididymidis beim Nager konnten wir Organbad-Untersuchungen eta­blieren [58], aufgrund dünnerer Wandstärken waren proximalere Nebenhodenanteile oder Tubuli seminiferi dieser ­Methode jedoch nicht zugänglich. Wir entwickelten daher ein „Time-lapse imaging“-Mikroskopie-Verfahren, das die Untersuchung der Kontraktilität von Tubuli seminiferi und einzelnen Abschnitten des D. epididymidis [59] unter beinahe physiologischen Bedingungen und die gezielte Austestung von Pharmaka am Gewebe ermöglicht.

Die Tubuli seminiferi der Ratte, die von einer einzelnen Zelllage peritubulärer Muskelzellen umgeben sind, zeigen ein spontanes, jedoch irreguläres, undulieren­des Kontraktionsmuster. Zur weiteren Charakterisierung setzten wir die Fourier-Analyse ein, die eine Darstellung dieser irregulären Aktivität als Frequenzspek­trum erlaubt. Allein der optische Vergleich der so generierten Frequenzspek­tren erlaubt eine rasche Erfassung von Veränderungen, die durch die Zugabe unterschiedlicher Pharmaka erzeugt werden. Außerdem konnten bestimmte typische Spektralkonfigurationen verschiedenen, durch Transillumination zu unterscheidenden Regionen der Spermato­genese zugeordnet werden.

Im Gegensatz zu Ratte und Maus enthält die peritubuläre Lamina propria humaner Samenkanälchen mehrere Schichten peritubulärer Zellen, die von kollagenen Fasern getrennt sind [60, 61]. Menschliche Tubuli seminiferi zeigen ebenfalls spontane Kontraktionen, die jedoch sehr langsam und eher peristaltisch ablaufen und sich klar vom Kontraktionsmuster bei der Ratte unterscheiden. In Fällen mit fibrotischen Veränderungen der Lamina propria, die bei einem großen Teil von Spermatogenesestörungen vorhanden sind, konnten keine Kontraktionen beobachtet werden. Die weitere Charakterisierung peritubulärer Zellen zeigte die Kolokalisation von Markern für glatte Muskulatur wie auch für Bindegewebe in einer einzelnen Zelle mit einem Überwiegen der Bindegewebsmarker, das auch in klassischen glatten Muskelzellen wie z. B. aus der Pulmonalarterie und der Prostata auffiel. Neben der kontraktilen Funktion haben menschliche peritubuläre Zellen auch diverse andere wichtige Funktionen. Hierzu gehören u. a. sekretorische Funktionen [62], ein Einfluss auf die Keimzellen [63], eine Rolle beim postnatalen Wachstum des Hodens [64], eine Bedeutung für die Definition der spermatogonialen Stammzellnische, sowie wichtige Interaktionen mit den lokalen Abwehrzellen.

Im Nebenhodengang konnten anders als in den Tubuli seminiferi regelmäßige, spontane, nicht neuronal vermittelte Kontraktionen nachgewiesen werden, die den intraluminalen Inhalt bewegen [58] und in Caput, Corpus und Cauda ein unterschiedliches Muster von Frequenz und Amplitude aufweisen [56, 58]. So genannte „Segmente“, die durch interstitielle bindegewebige Septen abgegrenzt werden, stellen eine feinere Gliederungsmöglichkeit des Organs dar als die gröbere in Kopf, Körper und Schwanz [65, 66]. Neueste Untersuchungen deuten darauf hin, dass in diesen Segmenten ein unterschiedlicher muskulärer Tonus vorliegt. Dies zeigt sich einerseits in einem Modell der aszendierenden, bakteriellen Epididymitis, bei dem im Segment unmittelbar oberhalb des noch luminal Bakterien enthaltenden ein geringerer Gangdurchmesser auffällt [66]. Weiterhin findet sich in den einzelnen Segmenten unterschiedliche Expression von Enzymen, die die Kontraktilität beeinflussen [67].

Obwohl der Transit der reifenden Spermatozoen durch Hoden und Nebenhoden Kontraktionen der glatten Muskulatur erfordert, darf der Transport andererseits nicht zu schnell sein, sodass auch relaxierende Einflüsse von Bedeutung sind. Das cGMP-System, dessen Komponenten in Hoden und Nebenhoden exprimiert sind [56, 58, 67, 68], vermittelt die Relaxation glatter Muskulatur. Die Anhebung von cGMP durch NO oder Sildenafil als einem Inhibitor der cGMP-abbauenden Phosphodiesterase-5 (PDE5) führt in beiden Organen zu einer Verlangsamung der kontraktilen Frequenzen, ohne dass eine Dauermedikation im Tiermodell zur Aufhebung von spontanen Kontraktionen führt [58]. Neben der PDE5 kommen auch die meisten anderen der 11 bekannten PDE-Familien, die cGMP und/oder cAMP abbauen (und so Kontraktilität beeinflussen), in peritubulären Zellen menschlicher Proben vor. Ein besonders interessanter Befund war die fehlende Expression eines Vertreters aus der PDE1-Familie in fibrotisch veränderter im Vergleich zur normalen Lamina propria und seiner Re-Expression unter Kulturbedingungen.

Ein besseres Verständnis für das Zusammenspiel von Kontraktilität, Fibroseentstehung und der Rolle cGMP-abhängiger Signalwege eröffnet neue Optionen zur Behandlung der männlichen Infertilität. Dies ist insbesondere unter dem Aspekt, dass cGMP-Signalwege durch NO, natriuretische Peptide oder unterschiedliche Phosphodiesterase-Hemmer bereits therapeutisch beeinflusst werden, von besonderer Bedeutung.

Der Histon-Protamin-Austausch und die Rolle der Rest-Histone in Spermien (KS, APD, WW)

Während der Spermiogenese wird die Mehrzahl DNA-bindender Histone durch Spermien-spezifische Protamine ersetzt (Abb. 3). Obwohl Spermatozoen transkriptional inaktive Zellen sind [69], weisen die in ihnen verbleibenden Histone (Rest-Histone) eine Vielzahl epigenetischer Modifikationen auf. Vor Kurzen wurde am Mausmodell gezeigt, dass das Spermium bei der Befruchtung neben seinem haploiden Genom auch epigenetische Informationen auf die Eizelle überträgt und nachweislich bis zur F2-Generation weitervererben kann [70].

Im Rahmen unserer Untersuchungen führten wir zunächst eine Chromatin-­Im­munpräzipitation (ChIP) mit einem Antikörper gegen die Histonmodifika­tion H4K12ac (Histon H4 mit einer Acetylgruppe an Lysin 12) an Samenproben von fertilen Spendern durch. Das an H4K12ac gebundene Chromatin wurde anschließend einer Promotorarray-Analyse (ChIP-on-chip) unterzogen [71]. Es fand sich eine Anreicherung von H4K12ac-Bindungsstellen in Promotoren von Genen, die in Entwicklungsprozesse der frühen Embryogenese involviert sind. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von einer amerikanischen Arbeitsgruppe publiziert [72]. Weiterführende Analysen zeigten, dass die identifizierten Kandidatengene mit einem hohen Level ihrer korrespondierenden Transkripte in Spermien korrelierten [73]. Hierbei wurde die höchste mRNA-Konzentration für das Hoden-spezifische PHD-Finger-Protein-7 (PHF7) gefunden. Im Mausmodell konnte H4K12ac vom männlichen Pronukleus bis zu frühen Stadien der Embryogenese nachgewiesen werden. Ein Vergleich unserer Ergebnisse mit Datenbanken zur Genexpression in humanen Embryonen ergab, dass die mit H4K12ac-assoziierten Genpromotoren nur schwach mit den im 4-Zell-Stadium exprimierten Genen korrelierten. Demgegenüber gab es Übereinstimmungen mit 23 Genen des 8-Zell-Stadiums und 39 Genen des Blastozysten-Stadiums.

Um zu klären, ob eine von der Normal­situation in fertilen Spendern abweichende Histonacetylierung oder DNA-Methylierung für eine männliche Subfertilität verantwortlich sein könnte, wurde ChIP-on-chip für H4K12ac auch an Samenproben von subfertilen Patienten mit Störungen der Chromatinkondensation (Nachweis durch Anilin-Blau-Färbung) durchgeführt. Ausgewählte Genpromotoren wurden anschließend einer Pyrosequen­zierung unterzogen, um den Grad der DNA-Methylierung zu bestimmen [74]. Zwar konnte an einigen entwicklungsrelevanten Genen eine Reduzierung der H4K12ac-Bindung nachgewiesen werden, doch existierte kein signifikanter Unterschied in der DNA-Methylierung zwischen fertilen Spendern und subfertilen Patienten. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Veränderungen der H4K12ac-Bindung nicht mit einer Änderung der DNA-Methylierung einhergehen.

Im Rahmen der Etablierung eines ELISA-Tests zum Nachweis von Spermien-Pro­taminen kam es zu einem überraschenden, aber interessanten Nebenbefund. So resultierte die Expression humaner Pro­tamine sowohl in prokaryotischen E. coli als auch in eukaryotischen HeLa-Zellen innerhalb kürzester Zeit zu einem kompletten Stopp der Zellproliferation, der nach Entfernung der Protamine rückgängig gemacht werden konnte [75]. Wir vermuten als Ursache die hohe Bindungsaffinität der Arginin-reichen Pro­tamine an das negativ geladene Rückgrat der DNA. Sollte sich diese Beobachtung in weiteren Experimenten bestätigen, dann könnte dies in Zukunft eine alternative und effektive Möglichkeit darstellen, um das Wachstum bestimmter Krebszellen mit hoher Proliferationsrate innerhalb eines Gewebeverbands spezifisch zu stoppen.

Die Übertragung (epi)genetischer Faktoren vom Spermium auf den frühen Embryo (US)

Nukleosomale Strukturen, die während der Spermiogenese vom Austausch durch Protamine verschont bleiben, stellen eine Besonderheit des Spermien-Epigenoms dar. Da sie in spezifischen Genombereichen angesiedelt sind und bestimmte posttranslationale Histon­modifikationen aufweisen, wird ihnen eine potentielle Bedeutung für die frühe Embryogenese und im Transgenerationen-Kontext zugeschrieben. Bislang existierende Daten und Publikationen zur Genom-weiten Verteilung von Spermien-Nukleosomen bzw. deren biologischer Funktion weisen keinen Konsens auf. So konnten frühere nChIP-Seq-basierte Arbeiten an Spermien von Mensch und Maus zeigen, dass Histone vorwiegend in CpG-reichen hypomethylierten Promotoren von Genen mit „house-keeping“ und entwicklungs-relevanten Funktionen (z. B. HOX-Genen) zu finden sind [71, 72, 76, 77]. Zahlreiche andere Arbeiten aber, die grundlegend andere unabhängige methodische Ansätze verwendeten (FISH, Immunfärbung oder „small-scale“- Klonierung), konnten im Gegensatz dazu nachweisen, dass die große Mehrheit der Spermien-Nukleosomen im perizentrischen Heterochromatin und in repetitiven DNA-Elementen (z. B. LINE [long interspersed nuclear elements] und SINE [small INE]) zu finden sind [78–81].

In dem vorliegenden Projekt wurde mittels MNase-Verdau die nukleosomale DNA-Fraktion aus humanen und bovinen Spermien isoliert und ohne weitere Anreicherung mit Antikörpern direkt mittels Illumina-Technologie sequen­ziert. Ziel war es, mittels unterschiedlicher Säugetier-Modelle ein universelles Genom-weites Profil der Nukleosomverteilung zu ermitteln, welches die hohe Wahrscheinlichkeit der Nukleosom-Konservierung auch außerhalb der kodierenden Bereiche und Promotoren berücksichtigt [82]. Unsere Ergebnisse bestätigten für beiden Organismen, dass die große Mehrheit der putativen nukleosomalen Bindestellen im intergenischen Bereich liegt und mit bestimmten repetitiven DNA-Elementen (LINE1, SINE, Centromer-Repeats) assoziiert sind. Des Weiteren wurde bei Mensch und Rind ein geringer Anteil an putativen Bindungsstellen in Genpromotoren von RNA- und Protein-prozessierenden Faktoren, Signaltransduktoren und Faktoren für die Mitochondrienfunktion gefunden. Die transkriptionale Aktivität dieser Gene bzw. Genklassen konnte in der Präimplantationsphase von menschlichen und Mäuse-Embryonen gezeigt werden [83]. Interessanterweise waren sowohl bei humanen als auch in bovinen Spermien keine putativen nukleosomalen Bindestellen im HOX-Gencluster zu finden. Nukleosom-abgereichert waren außerdem Bereiche von repetitiven Elementen wie LINE2, LTR (long terminal repeats) und einfache Repeats. Parallel zu unserer Arbeit hat eine andere Gruppe via „paired-end“-Genom-weiter Sequenzierung die gesamte MNase-erzeugte ­nukleosomale DNA-Leiter untersucht und ebenfalls zeigen können, dass die Spermien-Nukleosome vorwiegend in intergenischen Gen-armen Bereichen liegen und, Genom-weit betrachtet in Genpromotoren, inklusive die der HOX-Gene, stark abgereichert sind [84]. Außerdem wurde in dieser Studie alternativ mit einer unabhängigen Methode (FISH-Nachweis der Histone H4 und TH2B) demonstriert, dass im Spermium die meisten Nukleosomen im Heterochromatin-reichen Chromozentrum liegen.

Basierend auf unseren Ergebnissen vermuten wir, dass die Spermien-spezifischen Nukleosomen vornehmlich in der Präimplantationsentwicklung für die Centromerfunktion, aber auch für die epigenetische Regulation bzw. Suppression von Retrotransposons relevant sind. Weiterführende Studien im Bereich der molekularen Embryologie unter Einsatz von Tiermodellen sind notwendig, um dies zu klären und, darüber hinaus, die Bedeutung des Spermien-Epigenoms in idiopathischen Fällen der männlichen Infertilität, im Einsatz der ART (assisted reproductive technology) und im Genera­tionen-übergreifendem (transgenerationalen) Kontext zu verstehen (Abb. 4).

• Relevanz für die Praxis

Neben einer Vielzahl von grundlegenden Erkenntnissen zu molekularen Regulationsmechanismen der männlichen Keimzellentwicklung bei Mensch und Tier wurde von der Gruppe auch eine Reihe von praxisrelevanten Ergebnissen erzielt:

• So korreliert eine Atherosklerose-bedingte Mangeldurchblutung des Hodens im Mausmodell mit einem verminderten Gefäßvolumen und einer reduzierten Kapillardichte. Der eingeschränkte Blutfluss resultiert in Schädigungen der Spermatogenese, verringerter Spermienzahl, reduziertem Serum-Testosteronspiegel, systemischen und lokalen Entzündungen sowie einer verminderten Wurfgröße in der F1-Generation.
• Infektionen des Hodens, die im Rattenmodell durch uropathogene E. coli (UPEC) induziert werden, führen zu einer Schädigung der Spermatogenese und einer Verringerung der Spermienzahl, wobei Nekrose den bevorzugten Signal­transduktionsweg zum Zelltod darstellt. UPEC hemmen die Verteidigungsantwort des Wirts durch Hemmung der Expression anti-bakterieller Defensine im Nebenhoden. Defensinsubstitution führt zu einer effizienten Eliminierung des Pathogens.
• Subfertile Patienten zeigen außer Meiose-Defekten auch eine reduzierte Anzahl an Sertoli-Zellen und Stammzellen. Diese Defekte (Sertoli- und Keimzellen) konnten von den meisten Patienten mit histologisch normaler Spermatogenese oder Hypospermatogenese in der Meiose ausgeglichen werden. Clus­terin, ein androgen- und TGF-beta-abhängiges Protein, nutzt die Multi-Ligand-Rezeptoren „very low den­si­ty lipoprotein receptor“ (VLDLR) und Apolipoprotein-E-Rezeptor 2 (ApoER2) und erhöht die Protein-Expression und Phosphorylierung von einigen Proteinen, die bei der Meiose wichtig sind.
• Es sind zahlreiche verschiedene Transkriptionsfaktoren, Bromodomänenproteine und Histonmodifikationen für eine korrekte Differenzierung muriner und humaner haploider Spermatiden notwendig.
• Im Mausmodell führen Peroxisomen-Fehlfunktionen in Spermatogonien zu Spermatiden-Reifungsdefekten und Störungen der Blut-Hoden-Schranke, in Sertoli-Zellen zu einem Sertoli-Cell-Only- (SCO- ) Syndrom mit begleitender Hodenentzündung und Herabsetzung der Testosteronsynthese in Leydig-­Zellen. In Patienten mit bunter ­Atrophie konnte eine Reduzierung des Pex13-Proteins in apoptotischen Spermatozyten nachgewiesen werden.
• Im Rattenmodell weisen Hodenkanälchen komplexe und irreguläre Kontraktionen der Lamina propria auf, der Nebenhodengang zeigt hingegen regelmäßige Kontraktionen. In humanen Hodenkanälchen laufen spontane Kontraktionen langsamer und in Form eines peristaltischen Musters ab. Hodenkanälchen mit fibrotisch verdickter Lamina propria zeigen keine Kontraktionen. Die Tatsache, dass PDE1C ausschließlich in solchen Hodenkanälchen fehlt, lässt eine Rolle dieses Enzyms bei der Fibroseentstehung vermuten.
• Es war bereits bekannt, dass die Expression von Protamin in elongierenden Spermatiden über eine Kondensation des Kernchromatins zu einem Stopp der Transkription führt. Transfiziert man Protamin in E. coli- oder HeLa-Zellen, die selbst kein Protamin besitzen, so kommt es zu einem Stopp der Zellproliferation, was für einen generellen Reaktionsmechanismus spricht. Diese Beobachtung könnte in Zukunft zu einem neuartigen Ansatz für eine spezifische Behandlung von Krebszellen beitragen.
• Es wird vermutet, dass das Spermium bei der Befruchtung neben dem haploiden Chromosomensatz auch epigenetische Information auf die Eizelle überträgt. Mittels ChIP-on-chip wurden Genom-weit Bin­dungs­stellen von H4K12ac in humanen Spermien identifiziert. Hierbei wurden signifikante Unterschiede zwischen den Daten von fertilen Spendern und subfertilen Männern gefunden, was eine wichtige Rolle von Histonmodifikationen für die männliche Fertilität und eventuell für den frühen Embryo vermuten lässt.
• Parallele Untersuchungen an humanen und bovinen Spermien legen ein universelles Muster des Nukleo­somenrückhalts im Spermienchromatin nahe. So finden sich Nukleosome vornehmlich in distalen intergenischen Bereichen des Spermiengenoms und assoziieren mit Retrotransposonelementen (LINE1, SINE) und Zentromer-spezifischen repetitiven Elementen. Im Gegensatz zur vorherrschenden Meinung wurden Genpromotoren und Exone im Spermiengenom vorwiegend als Nukleosomen-arm bzw. Nukleo­somen-frei vorgefunden. Von diesem Trend wichen nur wenige Genpromotoren ab (u. a. Promotoren von Genen für Faktoren der RNA- und Protein-Prozessierung), die gleichzeitig zu einer Nukleosomenanreicherung führten und CpG-hypomethyliert waren.
• Danksagung

Die Autoren bedanken sich bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung der Klinischen Forschergruppe (KFO) 181 sowie bei allen wissenschaftlichen und technischen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern, die an den Teilprojekten beteiligt waren und somit zum Gelingen des Gesamtprojekts beigetragen haben. Die Kerngruppe der KFO 181 etablierte während der beiden Förderperioden der KFO 181 die beiden Plattformen Laser-Zell-Mikrodissektion und Epigenetik. Dies wäre nicht möglich gewesen ohne die Beschaffung eines Carl Zeiss/PALM MicroBeam durch die von Behring-Röntgen Stiftung sowie des RotorGene (Qiagen) und des Pyromark Sequenzers (Qiagen) durch die DFG.

• Interessenkonflikt

Alle Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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